Morfología
La plataforma de Morfología del Cima es un servicio de apoyo a los investigadores, tanto de nuestro centro como de otras empresas, un servicio de histología especializado en el procesamiento de muestras.
Concretamente, se ofrecen las siguientes técnicas:
- Procesamiento de tejidos en parafina: inclusión, corte y tinción.
- Procesamiento de tejidos congelados: congelación, corte y tinción.
- Técnicas inmunohistoquímicas/inmunofluorescencia: asesoramiento, realización y puesta a punto de anticuerpos. Marcajes simples y múltiples.
- Diseño y elaboración de Tissue Microarrays (TMAs).
- Diseño de experimentos que impliquen técnicas histológicas.
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Servicios de nuestra plataforma
Unidad de apoyo a la investigación
Procesamiento de muestras biológicas
Inclusión, corte y tinción de muestras en parafina. Corte y tinción de muestras congeladas. Inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, construcción y corte de TMAs.
Uso de equipos
Los investigadores tienen a su disposición, previa reserva, el uso de nuestros equipos para la preparación de las muestras.
Procedimientos para la extracción de muestras
Recoger las muestras con material de disección afilado. Sujetar y cortar las muestras por los bordes y sin presionarlas, de forma que las áreas de interés no resulten dañadas. A veces, es mejor realizar el tallado una vez que las muestras estén parcial o totalmente fijadas (dependiendo de su tamaño). Las muestras deben introducirse en el fijador lo antes posible para evitar la autolisis. Es mejor fijar cada muestra (o grupo de muestras identificables) en un frasco (de boca ancha) individual del tamaño adecuado, según el volumen de fijador necesario. En la mayor parte de los casos, son adecuados los frascos de orina de 100 ml.
Los tejidos frescos tienden a pegarse unos a otros y al fondo del frasco, lo que dificulta la fijación. Por ello, es conveniente agitar los frascos una o dos veces para separar los tejidos entre sí y/o del fondo de los frascos. Si hay bastante sangre en el fijador tras la recogida del tejido, cambiarlo por fijador nuevo. No se debe reutilizar el fijador.
- Volumen de fijador: La proporción de fijador/tejido debe ser al menos 20:1 (vol/vol). Si la cantidad de fijador no es adecuada o la muestra es demasiado grande o gruesa el interior de la muestra no se fijará adecuadamente. Uno de los problemas que encontramos con más frecuencia es la fijación insuficiente. Cuando las muestras son grandes, es conveniente abrirlas por la mitad o hacer varios fragmentos de menor tamaño (espesor máximo de 3-4 mm). El color rojo-rosado de los tejidos frescos cambia a color pardo con la fijación. La presencia de una tonalidad rojo-rosada en cualquier parte de la muestra (incluido en el interior) es una señal de fijación insuficiente.
- Tiempo de fijación: Para piezas con un grosor de unos 3-4 mm es suficiente con un tiempo de fijación de 24-48 h. En piezas más gruesas, es frecuente observar que la periferia de la muestra está fijada, pero no así el centro de la misma. Por ello, en estos casos, conviene hacer fragmentos de grosor máximo de 3-4 mm para que la fijación sea adecuada.
Una vez finalizada la fijación, se retira el fijador, se lavan las muestras con agua corriente para eliminar los restos de fijador y se pasan a etanol al 70%. A continuación se introducen las muestras en cassettes debidamente identificados, tallándolas previamente, si es necesario.
Una vez que los cassettes están en etanol al 70%, es conveniente trasladar las muestras al Servicio lo antes posible para proceder a su inclusión en parafina. Los tejidos pueden permanecer unos días en etanol al 70%, pero no demasiados, ya que las muestras se deshidratan y endurecen por acción del etanol, lo que dificulta la posterior obtención de cortes óptimos. La mejor manera de almacenar muestras de tejido es en forma de bloques de parafina. Los bloques se pueden cortar y teñir posteriormente.
Para la fijación, utilizar frascos del tamaño adecuado para que se cumpla la proporción entre volumen de muestra y volumen de fijador. En la mayor parte de los casos es suficiente con frascos de 50 ó 100 ml.
Marcar los frascos (no las tapas, ya que se pueden producir errores por intercambio de las mismas) con la identificación de la muestra y cubrirla con cinta adhesiva transparente para evitar que se borre por contacto con etanol al 70%. Los frascos deben ser de boca ancha (p. ej. frascos de orina) para poder extraer la muestra con facilidad y sin dañarla.
No utilizar tubos de fondo cónico, ya que, las muestras se hunden, se pueden deformar adquiriendo la forma cónica del fondo y no hay cantidad suficiente de fijador en la proximidad de la muestra.
Para los cassettes, introducirlos en un frasco de boca ancha y de volumen suficiente para el nº de cassettes correspondiente. Utilizar tantos frascos como fuera necesario e identificar todos ellos con cinta adhesiva indicando el nombre del investigador y el nº de laboratorio.
Asegurarse que hay la suficiente cantidad de etanol al 70% para cubrir todos los cassettes (con relativa frecuencia encontramos que los cassettes de la parte superior no están cubiertos y las muestras se secan).
No utilizar los frascos reciclados de medios de cultivo ya que es complicado extraer los cassettes del interior.
Identificar los cassettes tal y como se indica a continuación. La identificación debe escribirse con lápiz de mina dura y fina, con letra clara y deberá ser inequívoca.
Algunos de los marcadores para histología u otro tipo de marcadores supuestamente resistentes a disolventes se borran parcialmente durante el proceso de inclusión, por la acción combinada de etanol, xilol y parafina caliente. Si esto ocurre, no se podrán identificar las muestras.
Los cassettes se deben identificar en el frontal. La información que aparezca en los laterales no se transcribirá en el porta. Las muestras se deben codificar, es decir, hay que utilizar una identificación para cada muestra que sea breve (no más de 6-8 caracteres), pero inequívoca. No se debe describir/resumir el experimento en el cassette. Las letras pequeñas son muy difíciles de leer correctamente, especialmente si están recubiertas de parafina. Prestar atención a los números como el 4 y el 9 y las letras C y G; D, O y Q; y U y V que a menudo resultan confusas.
*Las identificaciones ilegibles son uno de los problemas más frecuentes que encontramos.
Es muy conveniente realizar el tallado cuando las muestras ya se han fijado. Utilizar cuchillas bien afiladas. En caso contrario o si el tallado se realiza en el tejido fresco (no fijado) es muy probable que la muestra sufra desgarros y que la superficie de corte no sea plana. Esto dificultará el trabajo del personal técnico, se perderá más cantidad de tejido en el proceso de corte y se reducirá la calidad de los cortes obtenidos.
La finalidad del tallado es doble, por una parte permite una correcta deshidatación e inclusión en parafina y, por otra, indica la orientación que se debe dar a la pieza en el bloque de parafina para obtener los cortes con la orientación deseada. Las muestras no deben tener un espesor mayor de 3-4 mm (poco menos que la profundidad de los cassettes). En las muestras debe distinguirse claramente la orientación que debe tener la pieza para el corte. En el momento de la inclusión, las muestras se apoyarán sobre la superficie mayor que, además, deberá ser lo más plana posible. En el caso de que se requiera otra orientación de corte, se debe indicar expresamente en el momento de la entrega de las muestras en el Servicio.
Una vez talladas, las muestras se introducen en el correspondiente cassette previamente identificado y éste en un recipiente con etanol al 70%. Llevar las muestras al Servicio en breve para proceder a su inclusión en parafina.
Si existe una zona de particular interés en la muestra, como p. ej. un tumor, tallar el tejido de forma que la zona de interés quede cerca de una de las superficie de la muestra y colocar ésta hacia abajo en el cassette. Si la zona de interés es pequeña, ponerlo en conocimiento del personal del Servicio para que no se pierda. Hay que tener en cuenta que es muy difícil tallar e incluir la muestra de forma tan precisa como para saber con anterioridad al proceso de corte qué cortes contendrán la zona de interés. En estos casos, es aconsejable solicitar cortes seriados y recoger todos los cortes hasta estar seguros de haber obtenido la información necesaria. Siempre se puede volver a cortar un bloque y obtener cortes a mayor profundidad, pero los cortes desechados se pierden para siempre.
No introducir demasiados tejidos en el mismo cassette. En el caso de que se incluyan varias muestras, el tamaño de las mismas debe permitir que quepan de forma holgada en el cassette y todas en la base, es decir, nunca se deben introducir unas muestras sobre otras. Como regla general, colocar en el mismo cassette muestras de consistencia similar. Por ejemplo, no introducir juntos tejidos duros, como la piel, y tejidos blandos, como el bazo o el cerebro, ya que si la consistencia varía mucho no se podrán cortar todos adecuadamente. Tampoco es recomendable poner en el mismo cassette muestras de tamaño muy distinto. Por ejemplo, un ganglio de ratón con una muestra de hígado/riñón/pulmón, etc. Para cuando se obtenga una superficie aceptable de la muestra de mayor tamaño la pequeña habrá desaparecido, es decir, se habrá agotado sin haber obtenido ningún corte.
Si la muestra es muy pequeña, utilizar cassettes para biopsias (de agujero más pequeño) para evitar que la muestra se pierda en el procesamiento. Los cassettes para biopsias no deben utilizarse para muestras de mayor tamaño, que no corren el riesgo de salir por los agujeros del cassette en el proceso de inclusión en parafina.
Hay muchas variables que afectan a la calidad de los cortes congelados. Es posible que haya que probar varios métodos hasta encontrar el más adecuado. Tener en cuenta que puede ser difícil obtener cortes aceptables de algunos tejidos. Los tejidos grasos constituyen un buen ejemplo.
Se puede congelar tanto tejidos frescos como previamente fijados, depende de la compatibilidad con las técnicas que se vayan a aplicar posteriormente sobre los cortes. Los tejidos frescos se deben congelar inmediatamente tras la extracción. Tallar las muestras siguiendo unas pautas similares a las descritas en el apartado de muestras en parafina.
En el caso de que los tejidos sean fijados, es conveniente crioproteger las muestras antes de la congelación. Para ello, tras la fijación, las muestras se introducen en PBS-sacarosa al 20 % y se mantienen a 4ºC hasta que la muestra se hunda en la solución (habitualmente hasta el día siguiente). Congelar la muestra siguiendo uno de los métodos descritos.
Recomendamos, si es compatible con las muestras, incluirlas en OCT utilizando moldes para congelación (disponibles en el Servicio). El medio de inclusión ayuda a eliminar el calor de la muestra durante el proceso de congelación, ayuda a proteger al tejido de la desecación durante el almacenamiento y sustenta el tejido en el proceso del corte.
Utilizar el tamaño de molde apropiado para el tamaño de la muestra (debe caber en el fondo del molde dejando un espacio alrededor de la muestra). Marcar el molde (repetir en dos caras) con la identificación de la muestra utilizando un rotulador indeleble. Seguir las mismas reglas descritas para la identificación de los cassettes de parafina.
El volumen de OCT necesario dependerá del tamaño de la muestra, debe cubrir y sobrepasar unos 2 mm la muestra. Echar OCT en el molde previamente identificado con cuidado de no formar burbujas ya que dificultan bastante la obtención de cortes adecuados. Si hay burbujas eliminarlas con ayuda de unas pinzas. Introducir la pieza de tejido hasta el fondo en la orientación deseada, evitando la formación de burbujas.
Si el tejido no está fijado, congelar lo antes posible siguiendo uno de los métodos descritos a continuación. Si el tejido está fijado, colocar la pieza sobre papel de filtro para que se absorba la solución crioprotectora (PBS-sacarosa) de la superficie de la muestra. Introducir la pieza en el molde con OCT tal y como se ha descrito anteriormente.
Un método sencillo consiste en realizar la congelación con hielo seco (-78ºC) en forma de pellet en una caja de poliestireno expandido (porexpán o corcho blanco). Este método tiene ventajas por su seguridad y sencillez y resulta más útil y cómodo cuando se va a congelar un número relativamente elevado de muestras. Introducir el criomolde con el OCT y la muestra en el hielo seco de forma que la superficie de OCT quede horizontal. Esperar a que se congele. Almacenar las muestras congeladas a -80ºC. En ningún caso se deben introducir las muestras congeladas en nitrógeno líquido (-196ºC) ya que es muy probable que los bloques se agrieten debido al brusco cambio de temperatura. El proceso de corte y, por tanto, la calidad de los cortes se verán afectados.
El mejor método consiste en utilizar isopentano (2-metil-butano) preenfriado hasta su punto de congelación (-160ºC) ya que la congelación es más rápida que con el método anterior. Introducir un vaso de precipitados Pyrex con isopentano en un vaso Dewar con N2 líquido con cuidado para que el N2 no se mezcle con el isopentano. Utilizar unas pinzas largas o, mejor aún, un soporte con asa para el vaso diseñado para este uso. Sacar el vaso cuando el isopentano comienza a congelarse (aparecen una especie de lentejas blancas en el fondo). Con la ayuda de unas pinzas, introducir el molde de congelación con OCT y la muestra correctamente orientada en el isopentano sin llegar a sumergirlo y mantenerlo hasta que se haya congelado. Sacar la muestra del isopentano y mantenerla en hielo seco. Enfriar el isopentano de nuevo tantas veces como sea necesario para congelar todas las muestras de tejido.
El músculo constituye la excepción en lo relativo a los métodos de congelación tejidos.
Debe congelarse utilizando isopentano frío o aparecerán artefactos por la formación de cristales de hielo. Preenfriar el isopentano con N2 líquido tal y como se ha descrito anteriormente e introducir la muestra de músculo directamente en el isopentano frío (no utilizar OCT).
Guardar las muestras en criotubos debidamente identificados.
Las muestras congeladas se almacenan en un congelador a -80ºC. Hay que proteger las muestras de la desecación, incluso aunque estén congeladas en medio de inclusión (OCT), para que no se estropeen.
Cada muestra se puede envolver bien en papel de aluminio (mejor con doble capa), anotando la identificación de la muestra en el aluminio con rotulador indeleble (antes de envolver la muestra) para facilitar su posterior localización. Este paso no es necesario si las muestras se van a cortar inmediatamente después.
Introducir las muestras en cajas (aptas para -80ºC) debidamente identificadas y almacenarlas en el congelador. En todo caso, lo mejor es cortar y teñir los cortes lo antes posible. Las muestras congeladas bien protegidas de la desecación pueden almacenarse hasta 2-3 años a -80ºC. Si las muestras de desecan, el OCT adquiere un aspecto similar al plástico y es casi imposible cortar las muestras.
Instrucciones de entrega de muestras
*En el momento de la entrega de las muestras en el SM se debe adjuntar el correspondiente formulario de solicitud cumplimentado.
- Muestras para inclusión en parafina: Las muestras deben estar ya fijadas, talladas y en cassettes debidamente identificados. Los cassettes se entregarán dentro de un frasco cerrado y totalmente cubiertos con etanol al 70%. Identificar los frascos con el nombre del investigador y nº de laboratorio en una cinta adhesiva.
- Congeladas: las muestras se entregarán debidamente congeladas y se transportarán hasta el SM en hielo seco. Es conveniente contactar antes por teléfono con el personal del Servicio (x5022) para asegurar la recepción de las muestras.
Es conveniente adjuntar un listado de las muestras entregadas e indicar cualquier instrucción especial. Si las muestras se entregan sin instrucciones se incluirán, cortarán y teñirán siguiendo los protocolos estándar. Indicar las necesidades particulares cada vez que se entreguen muestras.
En la plataforma de Morfología guardamos un registro de todas las solicitudes, pero muchas veces transcurren meses desde la última solicitud similar y, a veces, es complicado saber si tomamos como referencia la correcta.
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