Reserva de los separadores celulares
El servicio asignará las horas solicitadas en función de las disponibilidades de equipos existentes y la lista de espera de usuarios.
- El impreso de solicitud no solo es necesario para la reserva de los separadores celulares, sino que también recogerá información esencial para que el servicio de citometría diseñe la estrategia de separación más adecuada.
- Las horas de utilización del equipo y prestación de servicios se facturarán de acuerdo con las tarifas vigentes.
- La anulación de reservas deberá realizarse, siempre que sea posible, antes de las 24 horas.
- La preparación de la muestra correrá a cargo del usuario, debiendo traerlas ya preparadas y listas para el análisis y/o separación. En el apartado de tecnologías encontrará algunos consejos e indicaciones para la adecuada preparación de las muestras.
- Es muy importante que se proporcione al servicio de citometría los controles adecuados, así como una muestra prueba, a fin de que el servicio pueda hacer las calibraciones y la plantilla del experimento, y pueda probar la estrategia de separación propuesta.
- Las imágenes resultantes del trabajo de separación se podrán exportar como ficheros FCS para que el usuario pueda disponer de ellas y analizarlas en los ordenadores habilitados para ello.
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Requerimientos para cualquier separación celular
Control negativo: células sin marcar o células marcadas con el isotipo control. (En caso de GFP células parentales).
Controles de compensación, si es necesario: Si la tinción es con varios fluorocromos serán necesarios los monomarcajes de cada fluorocromo.
El marcador de muerte celular será añadido por el servicio de citometría y su elección dependerá de la combinación de fluorocromos que haya en la muestra.
Los controles solo necesitan un volumen final de 500µl con 500.000 células. Se pueden traer en tubos de FACS en FACS Buffer o Sorting Buffer.
Traer las células a 4ºC y protegidas de la luz.
- Muestras en tubos estériles en hielo.
- Filtrarlas siempre mediante cellstrainer.
- La concentración será de 30x106 células/ml. Cuando las células sean mayores de 20 micras la concentración será de unos 10x106 células/ml.
En tubos de cultivo de 15ml pon 1ml de medio de cultivo conteniendo suero al 20% o FBS estéril.
Puede calcular el volumen aproximado de células que va a recoger y utilizar tubos más pequeños (tubos de FACS, eppendorf…), si lo desea consulte con el servicio de citometría.
- Tubos de citómetro: Ref. 352052 BD Falcon
- Tubo de 15ml polipropileno: Ref 430791 Corning o similar
- Cell strainer 50 micras (50 u): Ref. 352350 BD Falcon
- EDTA 0.5M pH8.0 (4X100ml): Ref. 15575-020 GIBCO
- Tubo de citómetro con cell-strainer cap: Ref. 352235 BD Falcon
1x PBS (sin Ca/Mg++)-1mM EDTA-25mM HEPES pH 7-0.5% Fetal Bovine Serum (Inactivado por calor)+ 1% antibióticos (penicilina y estreptomicina).
| 50 ml | |
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1x PBS (Ca/Mg++ free) |
Hasta 50 mL |
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2.5mM EDTA (stock 500mM) |
250 uL |
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25mM HEPES pH 7.0 (stock 1M) |
1.25 |
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0.5% FBS (Inactivado) |
250 uL |
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1% antibióticos (pen and strep) |
500 uL |
Conservar a 4ºC.
Si las células son adherentes se debe aumentar la concentración de EDTA a 5 mM.
Si hay un gran número de células muertas se recomienda agregar 10U/mL DNAasa II.
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Tamaño del orificio del nozzle |
Tipo celular |
Concentración final (por mL)* |
|---|---|---|
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70um |
Linfocitos, timocitos |
8-15 x 106 |
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80um |
Células activadas, líneas celulares pequeñas |
7-10 x 106 |
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100um |
Células adherentes, células grandes |
5-9 x 106 |
Selección del Nozzle y presión adecuados
El separador celular FACSAria II cuenta con tres tamaños diferentes de orificio de nozzle 70, 85 y 100 micras, y puede separar (sortear) las células utilizando diferentes presiones.
El tamaño del nozzle y la presión a utilizar están directamente relacionados con tamaño de las células que se desee separar. A mayor tamaño celular corresponderá un mayor orificio de nozzle, menor presión a utilizar y por lo tanto menor velocidad de separación.
Existen normas generales para determinar el tamaño de nozzle y la presión adecuados, sin embargo se pueden realizar variaciones dependiendo de la resistencia o fragilidad de las células a separar. Por ello, es muy importante informar al servicio de citometría si se experimentan problemas luego de la separación.
70 micras, separación a alta presión (70psi)
- Células de tejidos primarios: timo, bazo, médula ósea.
- Células de sangre periférica.
- Líneas celulares derivadas de células B y T.
85 micras, separación a presión media (45psi)
- Las listadas anteriormente pero que han sido transfectadas/transducidas con vectores de expresión.
- Células de cultivos primarios.
- Células activadas.
100 micras, separación a baja presión (20psi)
- La mayoría de las líneas celulares.
- Líneas celulares adherentes.
- Células grandes y delicadas de tejidos primarios (neuronas, células dendríticas).
- Células recién transfectadas que expresan GFP.
Concentración
celular
- Presión alta: 8-15 millones/ml (max. 22.000 cel/seg).
- Presión media: 7-10 millones/ml (max. 12.500 cel/seg).
- Presión baja: 5-9 millones/ml (max. 6.500 cel/seg).
* Estos valores corresponden a la concentración final luego del filtrado de la muestra por parte del servicio de citometría por lo que la muestra deberá ser proporcionada al doble de concentración.